孔雀石綠檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

1 孔雀石綠檢測試劑盒原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，同時把隱性孔雀石綠氧化成孔雀石綠，可檢測動物組織和水樣中的孔雀石綠（Malachite Green，MG）總量。試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的孔雀石綠和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中孔雀石綠的殘留量。
2 技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，10min～30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
魚/蝦等水產(chǎn)品 ……………0.5ppb
水樣 …………………………0.1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
顯性孔雀石綠………………………100%
結(jié)晶紫………………………………91%
隱性孔雀石綠（氧化后）…………100%
隱性結(jié)晶紫（氧化后）……………91%
 2.5 樣本回收率：
魚/蝦等水產(chǎn)品、水樣……………90%±10%
3 試劑盒組成
酶標板………………………………96孔
10×標準品(棕色蓋)：各0.5ml
0ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb
標準品稀釋液(藍蓋)………………10ml
10×濃縮酶結(jié)合物…………………1.6ml
10×濃縮抗體……………………0.8ml
底物液A(白蓋)………………………7ml
底物液B(黑蓋)………………………7ml
終止液(黃蓋)………………………7ml
10X濃縮洗滌液(白蓋)……………50ml
樣本稀釋緩沖液(紅蓋）………………5ml
氧化劑(黑蓋)…………………………3ml
說明書 ………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈、乙酸、二氯甲烷、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、正己烷
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
    首先將乙腈與二氯甲烷配成體積比為2:1混合液，然后向上述混合液中加入乙酸，使其終濃度約為1%，按需配制。（例：100ml 乙腈+50ml 二氯甲烷+1.5ml 乙酸。）
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 低脂肪含量樣品（羅非魚、鯽魚、鰱魚、鳙魚、草魚、蝦、鯉魚等）
1）魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品；
2）稱取2g均質(zhì)好的樣品，放入50ml離心管中，加入10ml樣本提取液(配液1)，立即搖勻，加入1g無水硫酸鈉，充分震蕩10min，4000r/min 離心5 min；
3）取7ml上清移至50ml離心管中，加入20ul氧化劑，震蕩2min，加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min，4000r/min離心5min。
4）取下層5ml，50-60℃下氮氣吹干。加入300ul 乙腈，渦旋使殘渣溶解（注意蓋緊蓋防止乙腈揮發(fā)掉）。
5）測定時取上述乙腈溶解液25ul，加50ul樣本稀釋緩沖液，175μl 蒸餾水，混合均勻，取50ul分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：3     檢測下限：0.5ppb
5.3.2 高脂肪含量樣品（鰻魚、鯰魚等）
1）魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品；
2）稱取2g均質(zhì)好的樣品，放入50ml離心管中，加入10ml樣本提取液(配液1)，立即搖勻，再加入1g中性氧化鋁、1g無水硫酸鈉，充分震蕩5min，4000r/min 離心5 min；
3）取7ml上清移至50ml離心管中，加入20ul氧化劑，震蕩2min，加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min，4000r/min離心5 min。
4）棄去全部上層正己烷層（注：中間蛋白脂肪層需棄除），再加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min，4000r/min 離心5min； 
5）取下層5ml，50-60℃下氮氣吹干，加入300ul 乙腈，渦旋使殘渣溶解（注意蓋緊蓋防止乙腈揮發(fā)掉）。
6）測定時取上述乙腈溶解液25ul，加50ul樣本稀釋緩沖液，175ul 蒸餾水，混合均勻，加入500ul正己烷渦旋2min，棄去全部上層正己烷，取下層50ul分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：3     檢測下限：0.5ppb
5.3.2水質(zhì)樣品
取水樣175ul, 加入50ul 樣本稀釋緩沖液, 25ul 乙腈，取50ul分析。 
樣本稀釋倍數(shù)：1.43    檢測下限：0.1ppb
注：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠；隱性孔雀石綠；結(jié)晶紫；隱性結(jié)晶紫的總量。
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前需：
配液A：洗滌工作液
將50ml 10×濃縮洗滌液用去離子水按1:9稀釋成500ml工作洗滌液備用。
配液B：活化劑工作液
將氧化劑按1:99體積進行稀釋（現(xiàn)用現(xiàn)配，按需配制）
配液C：抗體工作液
用配液A（洗滌工作液）將10×濃縮抗體10倍稀釋（臨時用時，按需配制）
配液D：酶標記物
用配液A（洗滌工作液）將10×濃縮酶結(jié)合物10倍稀釋（臨時用時，按需配制）
制備孔雀石綠標準液：
標準品溶液（0ppb，0.05ppb，0.1ppb，0.2ppb，0.4ppb，0.8ppb）
取6個1.5ml離心管，把標準品濃縮液用標準品稀釋液稀釋10倍（如：450ul標準品稀釋液加入50ul 10×標準品濃縮液）
6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 活化：加120ul活化劑工作液（配液B）到微孔中，室溫下反應(yīng)10min，倒掉拍干，加洗滌工作液（配液A）250ul/孔，洗滌5次，每次間隔30s，棄去孔中液體，在吸水紙上拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的吸頭戳破）。
6.3 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.4 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液工作液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干。
6.5 加酶反應(yīng)：加酶標記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.6洗    滌：同上
6.7 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.8 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.9 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝A×100%A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應(yīng)的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。